實驗步驟
首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配) ，再次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計應(yīng)注意如下要點：
1．引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp。
2．引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。
3．引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。
4．引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5．引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。合理的退火溫度從55℃到70℃。為獲得*結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。
6．引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。應(yīng)該盡量避免。
上海嘉鵬科技有限公司專業(yè)生產(chǎn)：紫外分析儀、三用紫外分析儀、暗箱式紫外分析儀、暗箱三用紫外分析儀、暗箱紫外分析儀、手提式紫外分析儀、三用紫外分析儀暗箱式、紫外檢測儀、部分收集器、恒流泵、蠕動泵、凝膠成像系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)、光化學(xué)反應(yīng)儀、旋渦混合器、漩渦混合器、玻璃層析柱、梯度混合器、梯度混合儀、核酸蛋白檢測儀、玻璃層析柱、熒光增白劑測定儀、餾分收集器、切膠儀、藍(lán)光切膠儀、層析系統(tǒng)等產(chǎn)品。咨詢。
在線客服
電話咨詢